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線粒體呼吸測定儀基本構(gòu)造
薄膜氧電極[2] 由L.C.Clark研制（1953），故亦稱Clark氧電極。氧電極實際上是一個電化學(xué)電池，由鑲嵌在絕緣材料上的銀極和鉑極構(gòu)成。銀極為陽極，一般制成圓環(huán)狀，作為參比電極，銀極的面積要盡可能大一些，以降低電機表面電流密度，減少陽極的極化現(xiàn)象，使其電機電位不受外加電壓的影響。鉑極為陰極，一般制成圓點狀，位于銀極的，電解反應(yīng)即發(fā)生在鉑極上。
在電極的表面用15~20μm的聚乙烯或聚四氟乙烯薄膜覆蓋，在電極與薄膜之間充以溶液作為電解質(zhì)。由于水中溶解氧能透過薄膜而電解質(zhì)不能透過，因而排除了被測溶液中各種離子電解反應(yīng)的干擾，成為測定溶解氧的專用性電極。
線粒體呼吸測定儀基本原理
當在氧電極兩極間施加電壓并超過O2的分解電壓（約為-0.2V）時，透過薄膜進入溶液的溶解氧便在鉑陰極上還原：
O2+2H2+4e= 4OH
銀陽極上則發(fā)生銀的氧化反應(yīng)：
4Ag+4Cl= 4AgCl+4e [3]
此時電極間產(chǎn)生電解電流。由于氧在陰極被還原，而使陰極表面氧的濃度降低，于是被測溶液中的溶解氧便向陰極擴散補充，使還原過程得以繼續(xù)進行，又由于電極反應(yīng)的速度極快，而氧分子的擴散速度則較慢，所以電解電流的大小受氧的擴散速度的限制。這種受氧擴散速度限制的電解電流叫做擴散電流。在溶液靜止、溫度恒定的情況下，擴散電流受被測溶液與電極表面O2的濃度差控制。隨著外加電壓的加大，電極表面O2濃度必然減小，被測溶液與電極表面O2的濃度差加大，擴散電流也隨之增大。但當外加的極化電壓達到一定值時，陰極表面氧的還原速率大大超過O2向陰極的擴散速率，使陰極表面O2的濃度趨近于零，于是擴散電流的大小取決于被測溶液中的氧的濃度（對于薄膜氧電極而言，也就是緊靠膜外側(cè)的O2濃度）。此時再增加極化電壓，擴散電流基本上不再增加，使極譜波（即電流-電壓曲線）產(chǎn)生一個平頂。將極化電壓選定在平頂?shù)闹胁浚s0.6～0.9V），可以使擴散電流的大小基本不受電壓微小波動的影響。即電壓在0.6～0.9V之間，氧電極輸出的電流與電極外面氧濃度之間有良好的線性關(guān)系。因此，在極化電壓及溫度恒定的條件下，擴散電流的大小即可作為溶解氧定量測定的基礎(chǔ)。電極間產(chǎn)生的擴散電流信號可通過電極控制器的電路轉(zhuǎn)換成電壓輸出，用自動記錄儀進行記錄。[4]
線粒體呼吸測定儀分類
國際普遍認可的高精度氧電極有以下幾種：Chlorolab-2液相氧電極，Oxygraph液相氧電極，Oxytherm液相氧電極等。
其中Oxytherm系列氧電有很強的精確控溫功能，更適宜進行線粒體呼吸的測定。
線粒體呼吸測定儀參數(shù)舉例
線粒體呼吸測定儀應(yīng)用領(lǐng)域
廣泛應(yīng)用于植物生理學(xué)、農(nóng)學(xué)、園藝學(xué)、林學(xué)、微生物學(xué)、藻類生物學(xué)、生命科學(xué)、海洋生物學(xué)、動物學(xué)，人體醫(yī)學(xué)以及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域。
l 測定動物、植物組織細胞、微生物的呼吸速率和呼吸途徑的變化，分析抗氰呼吸途徑、細胞色素氧化酶途徑、糖酵解途徑、三羧酸途徑的變化
l 測定動物、植物等線粒體的呼吸及I態(tài)、II態(tài)、III態(tài)、IV態(tài)呼吸，研究呼吸控制率及P/O比
l 測定有氧參與的酶促反應(yīng)過程。如多酚氧化酶、脂氧合酶、H2O2酶等活性
l 測定化學(xué)合成放氧物質(zhì)的放氧速率
Oxygtherm配用整合式的電子控溫裝置，可以在3℃～40℃之間精確地控制溫度，控溫精度為0.02℃ 。因此避免了使用超級恒溫水浴。Oxytherm可用于研究動物、植物、微生物及藻類等各種生物材料的耗氧及放氧過程。[5]
線粒體呼吸測定儀主要功能
l 高度整合的控制器。功能*的控制軟件，控制溫度和攪拌子轉(zhuǎn)速
l 自動采集數(shù)據(jù)，自動計算出呼吸速率
l 整合式半導(dǎo)體控溫裝置精確控溫
l 可以8臺系統(tǒng)聯(lián)用，同時監(jiān)測8個反應(yīng)室中O2濃度的變化
l 可與OXY/PHA離子選擇pH電極聯(lián)用，同時檢測反應(yīng)液中氧濃度和H濃度[6]
線粒體呼吸測定儀主要技術(shù)指標
l 樣品用量：0.2~2.5 ml
l 測量范圍：0~40% O2
l 氧分辨率：10×10μ mol· ml
l 控 制 器：計算機控制器與整合式磁力攪拌器，可控制攪拌轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速（150~900 rpm），計算機控制增益與補償功能，自動采集數(shù)據(jù)（0.1~10次/秒），RS232輸出
l 軟件功能：功能*的控制軟件。可控制溫度、攪拌轉(zhuǎn)子轉(zhuǎn)速，自動記錄氧信號的動態(tài)變化過程，自動計算呼吸速率
l 溫度控制：整合式半導(dǎo)體控溫裝置，控溫范圍3℃~40℃；控溫精度：0.02℃
l 電極輸出：21% O2 時為1 μA；10%~90% 響應(yīng)時間<5秒；耗氧量<0.015 μ mol · ht
l 殘余電流：<0.02 μA ；極化電壓：700 mA
l 工作電壓：100~240V，50/60 Hz，輸出12V DC，2.5A
l 控制器體積：190×120×85 mm；重量：350g[7]
使用氧電極測定線粒體實例：
Christian Frezza, Sara Cipolat, Olga Martins de Brito, Massimo Micaroni, Galina V. Beznoussenko, Tomasz Rudka, Davide Bartoli, Roman S. Polishuck, and others. OPA1 Controls Apoptotic Cristae Remodeling Independently from Mitochondrial Fusion. Cell,Vol. 126,Issue 1,p177–189
Sara Cipolat, Tomasz Rudka, Dieter Hartmann, Veronica Costa, Lutgarde Serneels, Katleen Craessaerts, Kristine Metzger, Christian Frezza, and others. Mitochondrial Rhomboid PARL Regulates Cytochrome c Release during Apoptosis via OPA1-Dependent Cristae Remodeling. Cell,Vol. 126,Issue 1,p163–175
Hsiuchen Chen, Marc Vermulst, Yun E. Wang, Anne Chomyn, Tomas A. Prolla, J. Michael McCaffery, David C. Chan. Mitochondrial Fusion Is Required for mtDNA Stability in Skeletal Muscle and Tolerance of mtDNA Mutations. Cell,Vol. 141,Issue 2,p280–289
Carolyn S. Sevier, Hongjing Qu, Nimrod Heldman, Einav Gross, Deborah Fass, Chris A. Kaiser. Modulation of Cellular Disulfide-Bond Formation and the ER Redox Environment by Feedback Regulation of Ero1. Cell,Vol. 129,Issue 2,p333–344
Geng Wang, Hsiao-Wen Chen, Yavuz Oktay, Jin Zhang, Eric L. Allen, Geoffrey M. Smith, Kelly C. Fan, Jason S. Hong, and others. PNPASE Regulates RNA Import into Mitochondria. Cell,Vol. 142,Issue 3,p456–467
BrookeM. Emerling, JonathanB. Hurov, George Poulogiannis, KazumiS. Tsukazawa, Rayman Choo-Wing, GerburgM. Wulf, EricL. Bell, Hye-Seok Shim, and others. Depletion of a Putatively Druggable Class of Phosphatidylinositol Kinases Inhibits Growth of p53-Null Tumors. Cell,Vol. 155,Issue 4,p844–857
WilliamJ. Israelsen, TalyaL. Dayton, ShawnM. Davidson, BrianP. Fiske, AaronM. Hosios, Gary Bellinger, Jie Li, Yimin Yu, and others. PKM2 Isoform-Specific Deletion Reveals a Differential Requirement for Pyruvate Kinase in Tumor Cells. Cell,Vol. 155,Issue 2,p397–409
參考資料
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